Лазерная технология структурирования поверхности дентальных титановых имплантатов (Часть 2)
В. П. Вейко (1) , Ю.Ю.Карлагина (1) , В. В. Романов (1) , Р. М.Яцук (1) , Е. Е. Егорова (1) , Е. А. Зерницкая (2), А. И.Яременко (2), Г. Н.Черненко (3) , С. Г. Горный (4), Г. В. Одинцова (1)
1 Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия.
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский стоматологический фрезерный центр и завод по изготовлению ортопедических компонентов «Lenmiriot», Санкт-Петербург, Россия
4 ООО «Лазерный центр», Санкт-Петербург, Россия
Первая часть настоящей работы посвящена разработке метода лазерного формирования биосовместимой морфологии поверхности титановых дентальных имплантатов, которая обеспечивает гидрофильную структуру поверхности, обладающую одновременно микро- и нанорельефом. В данной, второй, части исследования мы приводим результаты доклинических испытаний биосовместимости лазерно-индуцированных рельефов. Образцы с модифицированной поверхностью продемонстрировали развитую пролиферацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток по всей площади поверхности, даже в открытых порах. Имплантаты с такой поверхностью показали положительные результаты остеоинтеграции in vivo: спустя три месяца после имплантации в ранее разрушенной области кости образуется новая зрелая костная ткань, непосредственно сопряженная с поверхностью имплантата. Технология на основе данного метода была внедрена в производство стоматологического фрезерного центра полного цикла производства и завода, входящего в группу компаний «ОРТОС»
Ключевые слова: дентальные имплантаты, приживаемость, лазерная обработка поверхности, доклинические исследования, in vitro, in vivo, полный цикл производства
Статья поступила: 04.06.2020 Принята к публикации: 24.06.2020
ПРОВЕДЕНИЕ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ЛАЗЕРНО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ДЕНТАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ
В первой части работы посредством лазерного воздействия на поверхности титановых дентальных имплантатов были сформированы структуры двух типов – лунки (структура «Л», плотность мощности лазерного излучения 6,9· 107 Вт/ см2 в двухпроходовом режиме обработки) и канавки (структура «К», плотность мощности 63 · 107 Вт/ см2 в трехпроходовом режиме обработки). Изображения поверхности имплантатов до и после лазерной обработки, полученные методом сканирующей электронной микроскопии, приведены на рис. 1.
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/lazernaya-tekh-struk-implantatov-1-1%20%281%29.jpg)
Рис. 1. CЭМ‑снимки поверхности титановых дентальных имплантатов (a) – до, (b и c) – после лазерной обработки для структуры «К» и «Л», соответственно
Оценить качественно и количественно жизнеспособность клеток на инородных поверхностях – структурах, полученных до («П») и после («К» и «Л») лазерной обработки, возможно путем проведения in vitro исследования. В качестве модельной среды для исследований нами были выбраны мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые, в свою очередь, были выделены из костного мозга человека. Клетки, еще на стадии культивирования, были окрашены лентивирусными частицами, несущими ген флуоресцентного белка TurboFP635 (производство Евроген, Россия). Клетки были перемещены на поверхность образцов, расположенных в культуральных планшетах. Анализ результатов культивирования проводился спустя 1, 5, 10, 15 и 20 суток после перемещения клеток.
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/%D0%9B%D0%B0%D0%B7%D0%B5%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F%20%D1%82%D0%B5%D1%85%D0%BD%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F%20%D1%87%D0%B0%D1%81%D1%82%D1%8C%202%20%282%29.png)
Рис. 2. Качественный (a–b) и количественный (d) анализ пролиферации клеток на поверхности образцов до и после лазерной обработки. Масштабная шкала соответствует 300 мкм
В первый контрольный период, спустя сутки после высаживания клеток, последние были обнаружены на всех типах образцов (рис. 2). На структуре «П» клетки были расположены ровным слоем и имели фибробластоподобную вытянутую форму, что указывало на их нормальную адгезию. Однако день за днем исходное количество жизнеспособных клеток на поверхности структуры «П» уменьшалось и на 20-й день достигло нулевого значения. Структура «Л» в первый контрольный период была покрыта одиночными клетками округлой формы, характерными для неполной адгезии, однако на 20 день после переноса клеток на поверхность количество жизнеспособных клеток достигло значения 196000 клеток на образец. Клетки на структуре «К» в первый контрольный период были расположены ровным слоем и имели фибробластоподобную вытянутую форму, что указывало на их нормальную адгезию. На данной структуре наблюдалось наибольшее количество клеток в каждый контрольный период, и к концу исследования достигло 266500 клеток на образец – максимальное число среди всех образцов. На основе полученных результатов in vitro исследований можно сделать вывод о том, что оптимальной структурой из предложенных для МСК является структура «К»
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/lazernaya-tekh-struk-implantatov-2-2.jpg)
Рис. 3. Качественный анализ интеграции клеток вглубь структур «К» и «Л» Масштабная шкала соответствует 300 мкм
После исследования пролиферации клеток были получены поперечные срезы образцов для того, чтобы определить, прорастают ли они в глубь открытых пор структур или выстилают лишь поверхность. Полученные результаты демонстрируют, что клетки располагаются не только по поверхности структур, но также прорастают внутрь открытых пор. Качественный анализ показан на рис. 3.
Следующим этапом доклинических исследований является in vivo исследование. Для этих целей в качестве модельной среды были выбраны 15 кроликов (особи мужского пола, возраста 1,5 года).
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/lazernaya-tekh-struk-implantatov-2-4.jpg)
Рис. 4. Подготовка образцов для in vivo исследования: иссечение имплантата из бедренной кости кролика (a), образец среза имплантата, зафиксированного в метилметакрилате (b), и окрашенный образец талуидионовым синим (C)
Животные выводились из эксперимента в два этапа: спустя 1,5 и по истечении 3–х месяцев после имплантации. Иссеченные имплантаты с уже сформировавшейся на них костью подвергались диссекции (рис. 4а), помещались в формалин, проходили деградацию и фиксировались в метилметакрилате. Затем выполнялся срез с каждого образца толщиной менее 50 мкм (рис. 4b). Для проведения гистологического исследования образцы были окрашены с использованием красителя талуидионовый синий (рис. 4c).
Анализ полученных срезов осуществлялся методом оптической микроскопии (микроскоп Olympus BX 61). На снимках всех образцов (рис. 5) наблюдается пластинчатая кость с неравномерно расположенными гаверсовыми каналами, разными по диаметру. Это свидетельствует о том, что произошли перестроечные процессы в костной ткани. На всех структурах клетки зрелой костной ткани (остеоциты) встречаются по всему матриксу кости, видна молодая фиброзная ткань (окрашено синим цветом) и полноценная зрелая костная ткань (окрашена бежевым цветом).
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/lazernaya-tekh-struk-implantatov-2-3.jpg)
Рис. 5. Оптические снимки среза образцов до (a) и после (b и c) лазерной обработки для структуры «К» и «Л», соответственно
Было обнаружено, что, помимо наличия зрелой костной ткани на границе кость-имплантат и гаверсовых каналов, играющих важную роль в обмене веществ ткани, в полостях структур «К» (рис. 5b) и «Л» (рис. 5c) расположены остеоциты – зрелые клетки костной ткани. Их предшественники, остеобласты, в процессе формирования новой костной ткани «сочли» канавки и лунки подходящим местом для образования зрелой кости и, превратившись в остеоциты, «замуровались» в полостях лунок и канавок. По-видимому, такое поведение остеобластов связано с соизмеримостью размеров самих клеток с диаметром лунок и шириной канавок, что коррелирует с выдвинутой нами гипотезой об оптимальном рельефе.
![](https://cont.ws/uploads/pic/2022/12/%D0%9B%D0%B0%D0%B7%D0%B5%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F%20%D1%82%D0%B5%D1%85%D0%BD%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F%20%D1%87%D0%B0%D1%81%D1%82%D1%8C%203%20%281%29.png)
Рис. 6. Параметр остеоинтеграции BIC для границы кость-имплантат до (a) и после (b и c) лазерной обработки для структуры «К» и «Л», соответственно
Для количественного анализа полученных данных был рассчитан параметр BIC (Bone to implant contact), характеризующий процент участков границы имплантата, непосредственно контактирующих со зрелой костной тканью (рис. 6). Наибольшее значение параметра по полученным данным соответствует образцу «К». В целом по результатам in vivo исследования структура «К» также продемонстрировала наилучший результат остеоинтеграции.
ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДЕНИЯ В ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
В рамках настоящего исследования нами разработан метод лазерного формирования биосовместимого покрытия на поверхности титановых дентальных имплантатов, который позволяет получить гидрофильную структуру поверхности, обладающую иерархическим микро- и нанорельефом. Показаны результаты доклинических исследований биосовместимости лазерно-индуцированной поверхности на дентальном имплантате: подтверждено, что предложенные рельефы не являются цитотоксичными и обеспечивают развитую пролиферацию мультипотентных мзенхимальных стромальных клеток по всей площади поверхности, даже в открытых порах. Имплантаты, обладающие рассмотренной морфологией поверхности, показали положительные результаты остеоинтеграции в живом организме: спустя три месяца после имплантации в ранее разрушенной области кости присутствует новообразованная зрелая костная ткань, а в полостях лунок и канавок структур «Л» и «К», как в лакунах, расположились остеоциты.
На основе полученных результатов для Санкт-Петербургского стоматологического фрезерного центра и завода по изготовлению ортопедических компонентов для всех известных имплантационных систем под брендом «Lenmiriot» (группа компаний «ОРТОС») разработана технология создания дентальных имплантатов различного типа, которая уже находится на стадии запуска производства. Данный производитель является крупнейшим стоматологическим фрезерным центром полного цикла производства в России и имеет огромный потенциал стать флагманом импортозамещения в этой отрасли.
Ниже перечислены основные технологические этапы, выполняемые на производстве при создании дентального имплантата:
• из длинного титанового прута на фрезерном станке вытачиваются имплантаты;
• после вытачивания имплантаты проходят этап очистки от остатков фрезеровочных масел и других загрязнений;
• далее имплантаты отправляются на галтовку для очистки краев от заусенцев;
• затем имплантаты очищаются в ультразвуковой ванне со специальным моющим средством;
• после чего имплантаты проходят отдел контроля качества;
• затем снова отправляются на очистку в ультразвуковой ванне, упаковываются в специальные крафт-пакеты и стерилизуются;
• после чего, в «ламинарном шкафу» в стерильной среде имплантаты устанавливаются на оснастки для дальнейших операций;
• далее имплантаты проходят процедуру лазерного структурирования поверхности, которая состоит из следующих этапов:
◦ имплантат устанавливают на специальный поворотный механизм в рабочей области лазерного станка;
◦ далее поворотный механизм наклоняет имплантат под определенным углом для обработки боковой поверхности резьбы имплантата с одной и с другой стороны;
◦ после чего обрабатывается сама цилиндрическая поверхность имплантата (область на вершине резьбы и между зубчиками);
◦ далее обрабатывается поверхность вырезов, если они присутствуют;
◦ последним этапом обрабатывается торец имплантата;
◦ после обработки на лазерном станке имплантаты проходят контроль качества созданной структуры на оптическом микроскопе с большим увеличением;
• после чего имплантаты вновь очищаются в УЗ-ванне, стерилизуются и упаковываются.
• далее в «ламинарном шкафу» в стерильной среде имплантаты упаковываются в блистеры (конечная упаковка для хранения и продажи);
• после имплантаты в упаковках повторно стерилизуются (облучаются гамма-излучением);
• отправляются на склад/продажу.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами разработан полный цикл производства титановых дентальных имплантатов с лазерно-модифицированным биосовместимым покрытием, обладающим большим интеграционным потенциалом. Качество и новизна данной разработки способны конкурировать с зарубежным производством и обеспечить рынок нашей страны высокотехнологичным продуктом.
Хотя представленные результаты носят законченный характер, мы полагаем, что возможности использования лазерных технологий в целях улучшения качества титановых имплантатов далеко еще не исчерпаны. Поиск оптимальных морфологий поверхности, сочетание гидрофильных и гидрофобных участков на ней, наряду с использованием новых материалов, способны обеспечить дальнейший устойчивый прогресс в этой области.
Эксперименты in vitro и протоколы экспериментов были одобрены Советом по этике исследований Нижегородской государственной медицинской академии (Приволжский научно-исследовательский медицинский университет, г. Нижний Новгород) и соответствуют принципам Хельсинкской декларации.
Комитет ПСПбГМУ им. И.П.Павлова осуществляет свою деятельность в соответствии с Конституцией Российской Федерации, законами и другими правовыми актами Российской Федерации и Санкт-Петербурга, Хельсинской декларацией всемирной медицинской Ассоциации от 1964 года, дополненной в 1975, 1983, 1989, 1996, 2000 и 2013 годах международными стандартами по проведению клинических испытаний ICH Harmonized Tripartite Guideline for Good Clinical Practice (ICH GCP), стандартом отрасли ОСТ 42–511–99 «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации», вступившим в силу с 1 января 1999 года, Рекомендациями Комитетов по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований ВОЗ, Уставом ПСПбГМУ им. И.П.Павлова и Положением об этическом комитете ПСПбГМУ им. И.П.Павлова. Исследование «In vivo исследование процессов интеграции титановых дентальных имплантатов с модифицированной лазером поверхностью» одобрено (выписка из протокола №208 заседания этического комитета ПСПбГМУ имени академика И.П.Павлова от 25 июня 2018 года).
Авторы работы выражают благодарность научному коллективу ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (Нижний Новгород), в составе Дарьи Кузнецовой, Вадима Елагина и Елены Загайновой, за исследование биоинтеграции клеток на лазерноиндуцированной поверхности титана ВТ6 и сотрудникам Центра коллективного пользования научным оборудованием «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН (СанктПетербург) Зерницкому А.Ю. и Зотову П.А. за проведение гистологического и гистоморфометрического исследований
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 20-62-46045).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад членов творческого коллектива в проект
В проекте принимали участие все члены авторского коллектива: постановка задачи и обеспечение ресурсами – Г. Н. Черненко, С. Г. Горный; концепция, дизайн исследования и руководство проектом – В. П. Вейко, Г. В. Одинцова; проведение экспериментов по лазерному структурированию поверхности титана – Ю.Ю. Карлагина, В. В. Романов, Р.М. Яцук; концепция in vitro и in vivo исследований – А. И. Яременко; проведение и анализ in vivo исследований – Е.А.Зерницкая; анализ результатов in vitro и in vivo исследований – Ю.Ю. Карлагина, Е. Е. Егорова.
АВТОРЫ
В. П. Вейко (vadim.veiko@mail.ru), профессор, доктор технических наук, руководитель Международной научной лаборатории лазерных микро- и нанотехнологий, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0001-6071-3449
Ю.Ю. Карлагина (jujukarlagina@itmo.ru), инженер, Международная научная лаборатория лазерных микро- и нанотехнологий, аспирант, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-6927-9551
В. В. Романов (ionhcik@rambler.ru), инженер, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, аспирант, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0003-1468-9438 Р.М. Яцук (yatsuk.roman@mail.ru), инженер, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0003-2502-7501
Г. В.Одинцова (gvodintsova@itmo.ru), кандидат технических наук, научный сотрудник, Международная научная лаборатория лазерных микро- и нанотехнологий Университет ИТМО, факультет лазерной фотоники и оптоэлектроники, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0001-9581-4290
Е. Е. Егорова (elena1998959@gmail.com), студент, Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-1461-0673
Е.А.Зерницкая (zernitskaya_ekaterina@mail.ru), аспирант, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-3819-693X
А. И. Яременко (ayaremenko@me.com), д. м. н., профессор, заведующий кафедрой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, директор клиники челюстно-лицевой хирургии, проректор по учебной работе, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия. ORCID: 0000-0002-7700-7724
Г. Н. Черненко (office@ortos.biz), директор, Санкт-Петербургский стоматологический фрезерный центр и завод по изготовлению ортопедических компонентов «Lenmiriot», Санкт-Петербург, Россия.
С. Г. Горный(info@newlaser.ru), кандидат технических наук, ООО «Лазерный центр», Санкт-Петербург, Россия
Краткий словарь терминов
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) — мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки).
Пролиферация – процесс размножения клеток путем деления. Контактное ведение клеток – движение клеток вдоль линий механического напряжения микроструктуры субстрата.
Остеоинтеграция – анатомическая и функциональная прямая связь (стыковка) между изменяемой живой костью и поверхностью имплантата, на которую приложена функциональная нагрузка.
In vitro исследования – эксперименты, проводимые «в пробирке» — вне живого организма.
In vivo исследования – эксперименты, проводимые на (или внутри) живой ткани при живом организме.
Интеграционный потенциал – мера способности имплантатов интегрироваться в костную ткань, связанная с комплексом их свойств, оказывающих решающее влияние на течение и качество процесса интеграции и характеризующих имплантаты как активно взаимодействующий с прилежащей костной тканью компонент парной системы «имплантат – кость».
Photonics vol. 14 № 6 2020
Оценили 11 человек
14 кармы