Помнится, еще в начале 90-х в телекомпании «Останкино» я снял фильм о предприятии Геннадия Сухих. Именно тогда он и пошел в гору: поговаривали, что с помощью фетальной терапии пользуют самого дряхлеющего Ельцина. Потом эти видеоматериалы вошли в шестую серию моего цикла «Стук в Золотые врата». Интересующиеся могут посмотреть, в интернете можно найти. Зрелище, сразу скажу, не для слабонервных. По сути, эта работа – о новой, «научной» форме вампиризма, когда износившиеся в грехах персонажи пытаются подпитаться силой неродившихся младенцев. Все это ничем не лучше тех «адренохромных» ужасов, которые творятся в недрах американской политической и голливудской элиты и о которых прямо рассказал Мэл Гибсон. Для серьезного и не пугливого читателя рекомендую также свою книгу «Черный ящик», глава «Вампиризм как знамение эпохи».
Юрий Воробьевский. Черный ящик.
Патент Академика ублюдка Геннадия Сухих на мясо русских детей!
В работу принимаются плоды без генетических аномалий и без нарушений целостности кожных покровов.
Плод тщательно обрабатывают раствором детергента и отмывают дистиллированной водой. Пуповину отделяют. Затем забирают следующие органы: тимус, сердце, легкие, печень, селезенка, поджелудочную железу, надпочечники, почки, гонады, желудок, тонкий кишечник, брыжейка, спинной мозг, щитовидную железу, глаза. Кроме того, выделяют хрящи из всех суставов плода и снимается кожа с живота и спины. Перед разделением тканей мозга мозговые оболочки обязательно отделяются и в дальнейшем используются для получения клеточных культур. Из головного мозга забирают: мозжечок, мозговой ствол, эпифиз, гипоталамус, таламус, базальные ядра, затылочные доли, теменные доли, височные доли, лобные доли. Гипофиз не изолируется вместе со всем мозгом и может быть отделен в последнюю очередь.
Органы измельчают в стерильной чашке Петри стерильными, острыми ножницами до визуально гомогенного состояния, затем в гомогенат, добавляют 10 - 15 мл охлажденного (+4oC) стерильного физраствора и суспендируют стерильной пипеткой. После этого одноразовым шприцом через иглу 0,8х38 производят дополнительную гомогенизацию. Полученный гомогенат переносят в стерильные центрифужные пробирки, содержащие 5-кратный объем охлажденного (+4oC) стерильного физраствора.
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА ИЗ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
(19)
RU
(11)
2 160 112
(13)
C1
(51)
МПК
A61K 35/48(2006.01)
A61K 35/54(2006.01)
C12N 5/08(2006.01)
(21)(22)
Заявка:
2000108669/14, 2000.04.10
(24)
Дата начала отчета срока действия патента: 2000.04.10
(22)
Дата подачи заявки: 2000.04.10
(45)
Опубликовано: 2000.12.10
(72)
Авторы:
Сухих Г.Т.
(73)
Патентообладатели:
Сухих Геннадий Тихонович
(56)
Документы, цитированные в отчёте о поиске:
RU 2041715 C1, 20.08.1995.
RU 2132688 C1, 10.07.1999.
SU 1711896 A1, 15.02.1992.
FR 2413912 A1, 07.09.1979.
FR 2578743 A1, 19.09.1986.
DE 3410631 A, 27.09.1984.
EP 0249563 A1, 16.12.1987.
Реферат
Изобретение относится к области медицины и касается приготовления клеточных трансплантатов. Сущность изобретения: из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития выделяют клетки различных органов, суспендируют, отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры РСК, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате (Т) от 25х104до 10х107жизнеспособность всех клеток, составляющих Т, не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8-15%; спонтанная активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Са2+/Mg2+-зависимой эндонуклеазы 0,3 - 9 у.е., представленность маркера CD 95 - не более 5%. Клеточный трансплантат может включать дополнения, например ростовые факторы, и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты и т.д. Клеточные трансплантаты, полученные из фетальных тканей предлагаемым способом, эффективны и безопасны при использовании их при лечении широкого круга заболеваний. 9 з.п.ф-лы.
Формула изобретения
1. Способ приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей, характеризующийся тем, что из фетальных тканей абортивного плода 17 - 21 недели внутриутробного развития весом 150 - 450 г выделяют клетки различных органов, суспендируют их, отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры региональных стволовых клеток, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате от 25 х 104до 10 х 107, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат, не менее 80 - 90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8 - 15%; спонтанная активность Са2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Са2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы от 0,3 до 9 условных ед.; представленность маркера СД 95 - не более 5%.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточный трансплантат дополнительно включает ростовые факторы, и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты, и/или переносчики активных форм кислорода, и/или адаптогены, а также вещества, обладающие противовоспалительным, бактериостатическим действием.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что клеточный трансплантат, полученный предложенным способом, может быть использован при исследовании на контаминацию донора абортивного плода, исследовании на контаминацию абортивного плода, контроле стерильности тканевых суспензий.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при составлении трансплантатов подбирают ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения молодых пациентов должны содержать больше дифференцированных клеток и/или композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных региональных стволовых клеток.
6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в трансплантате для старых и пожилых пациентов должны преобладать региональные стволовые клетки.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения больных ишемической болезнью сердца должны содержать миоциты, бластные клетки печени, легкого, селезенки, сосудистого эндотелия.
8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантаты для лечения рассеянного склероза должны содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции.
9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что трансплантат для лечения анемий должен состоять преимущественно из региональных гемопоэтических клеток.
10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что клеточные трансплантаты могут быть использованы при лечении заболеваний нервной системы, болезнях эндокринной системы, нарушениях обмена веществ, болезнях крови, кроветворных органов и отдельных нарушениях, вовлекающих иммунные механизмы, для лечения новообразований, болезней глаз и его придаточного аппарата, болезней уха и сосцевидного отростка, болезней системы кровообращения, болезней органов дыхания, болезней органов пищеварения, болезней кожи и подкожной клетчатки, болезней костно-мышечной системы и соединительной ткани, состояний, возникающих в перинатальном периоде, травмах, отравлениях и других последствиях воздействия внешних причин.
Описание
Изобретение относится к области медицины и касается приготовления клеточного трансплантата из фетальных тканей для лечения широкого круга заболеваний.
В современной медицине отчетливо сформировалось отдельное направление, использующее тканевые и клеточные трансплантаты в терапевтических целях. Одним из научно-практических результатов этого направления является признание того, что фетальные ткани и клетки и их ассоциаты, а также биологически активные вещества из них обладают большей терапевтической эффективностью, чем зрелые ткани и дифференцированные клетки взрослого человека. Это обусловлено особыми свойствами клеток в период эмбриогенеза.
Прежде всего, в клетках II триместра гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II класса и поэтому при трансплантации они не вызывают иммунной реакции отторжения.
Во-вторых, эти клетки в значительно большей степени способны использовать эволюционно более древний энергетический путь - гликолиз и в связи с этим обладают большей устойчивостью к гипоксии, чем дифференцированные клетки взрослого человека. С терапевтической точки зрения это свойство важно в случаях, связанных с лечением ишемии органов и тканей реципиента, с технологической - для создания банков клеток и их ассоциатов с глубоким замораживанием, которое влечет за собой резкое снижение концентрации кислорода.
В-третьих, фетальные клетки очень пластичны и способны направленно изменять свои функции и свойства в зависимости от сигналов из окружающей среды, в том числе и от сигналов клеток реципиента. Последнее заставляет клетки мигрировать из области трансплантации в область конечной локализации и дифференцироваться в клетки соответствующей ткани. Именно это свойство высокой морфно-функциональной пластичности лежит в основе так называемой терапевтической полипатентности фетальных клеток и тканей.
Наконец, фетальные клетки в большей степени, чем клетки взрослого человека, содержат ростовые факторы, факторы миграции, стадиоспецифические белки, антиоксиданты и перехватчики активных форм кислорода, адаптогены, противовоспалительные бактериостатические соединения.
Таким образом, терапевтический эффект фетальных трансплантатов зависит не только от количества имплантированных фетальных тканей, клеток и их ассоциатов, но и от строгого соблюдения условий, обеспечивающих содержание в трансплантате клеток, обладающих всеми перечисленными выше уникальными свойствами.
Сегодня трудно перечислить все области применения фетальных тканей, клеток или препаратов на их основе. Достаточно сказать, что уже в настоящее время ряд клиник США и Европы успешно применяют фетальные клетки и ткани дефектов метаболизма печени, системных врожденных иммунодефицитов, нарушение гемопоэза, а также для лечения пациентов с мышечной дистрофией, дегенеративными заболеваниями нервной ткани, нарушениями репродуктивной системы, костной и хрящевой тканей, кожных покровов и т.д. Применение фетальных клеток в терапевтических целях стало возможным в связи с прогрессом в молекулярной и клеточной биологии, иммунологии, генной инженерии и других, смежных с перечисленными областях науки. В настоящее время не остается сомнений в эффективности фетальных клеток человека и вопрос их широкого применения в клинической практике больше связан с по меньшей мере двумя проблемами: во-первых, с разработкой технологий обеспечения безопасности трансплантата и технологий управления его эффективностью или терапевтической полипатентностью, во-вторых, с разработкой технологий получения нозологически специфических форм трансплантата.
Технической задачей настоящего изобретения является способ приготовления клеточного трансплантата с использованием биоматериалов из абортивного плода, позволяющий сохранить терапевтическую полипатентность этих биоматериалов и обеспечить безопасность метода, управляя качеством трансплантата на всех стадиях и этапах. Этот способ включает в себя подготовку трансплантата из фетальных тканей, получение суспензий для последующего получения компонентов клеточных трансплантатов и составление композиций трансплантата. Обеспечение безопасности трансплантата реализуется на основе комплексного подхода с исследованием на контаминацию донора плода, окончательной инъекционной формы трансплантата, а также с учетом условий сохранения антиканцерогенных свойств и гистосовместимости клеток трансплантата с клетками реципиента.
Установлены объективные количественные критерии качества трансплантата с учетом количества клеток в трансплантате, оценки жизнеспособности всех клеток, составляющих трансплантат, экспрессии антигенов гистосовместимости II класса, спонтанной активности Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы, индуцированной активности Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы, а также представленности маркера CD 95.
Для решения поставленной задачи предлагается способ приготовления клеточного трансплантата, согласно которому из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 грамм выделяют клетки различных органов, их суспендируют, затем отбирают суспензии с повышенным содержанием региональных стволовых клеток, отдельные идентифицированные культуры региональных стволовых клеток, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы) и биологически-активные вещества из фетальных тканей, при этом количество клеток в трансплантате от 25•104до 10•107, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат, не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8-15%; спонтанная активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы не менее 0,1 условной ед.; индуцированная активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы от 0,3 до 9 условных ед.; представленность маркера CD 95 - не более 5%. Клеточный трансплантат может дополнительно включать ростовые факторы и/или факторы миграции, и/или специфические белки, и/или антиоксиданты, и/или переносчики активных форм кислорода, и/или адаптогены, а также вещества, обладающие противовоспалительным, бактериостатическим действием. Клеточный трансплантат может быть использован при исследовании на контаминацию донора абортивного плода, исследований на контаминацию абортивного плода, контроле стерильности тканевых суспензий.
При составлении трансплантатов подбирают ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию.
При лечении молодых пациентов трансплантаты содержат больше дифференцированных клеток и/или композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных региональных стволовых клеток. Для старых и пожилых пациентов в трансплантате преобладают региональные стволовые клетки.
При лечении рассеянного склероза трансплантат должен содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции.
Трансплантаты для лечения больных ишемической болезнью сердца должны содержать миоциты, бластные клетки печени, легкого, селезенки, сосудистого эндотелия. При лечении анемий - региональные гемопоэтические клетки.
Клеточные трансплантаты могут быть использованы при лечении заболеваний нервной, эндокринной систем, нарушениях обмена веществ, болезнях крови, кроветворных органов и отдельных нарушениях, вовлекающих иммунные механизмы, для лечения новообразований, болезней глаз и его придаточного аппарата, уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, болезней кожи и подкожной клетчатки, костно- мышечной системы и соединительной ткани, отдельных состояний, возникающих в перинатальном периоде, травм, отравлений.
Для приготовления трансплантата необходимы абортивные плоды 17-21 недели внутриутробного развития весом 150-450 г. Допускается хранить в холодильнике при 4oC не более 4 ч. Это обеспечивает выход клеток с жизнеспособностью не ниже 85% (в тесте с трипановым синим). Абортивные плоды содержащие менее 70% жизнеспособных клеток, не могут быть использованы для подготовки трансплантата.
Ограничивающие условия определены нами опытным путем в результате анализа жизнеспособности клеток от 112 плодов (p<0,05). В работу принимаются плоды без генетических аномалий и без нарушений целостности кожных покровов.
Плод тщательно обрабатывают раствором детергента и отмывают дистиллированной водой. Пуповину отделяют. Затем забирают следующие органы: тимус, сердце, легкие, печень, селезенка, поджелудочную железу, надпочечники, почки, гонады, желудок, тонкий кишечник, брыжейка, спинной мозг, щитовидную железу, глаза. Кроме того, выделяют хрящи из всех суставов плода и снимается кожа с живота и спины. Перед разделением тканей мозга мозговые оболочки обязательно отделяются и в дальнейшем используются для получения клеточных культур. Из головного мозга забирают: мозжечок, мозговой ствол, эпифиз, гипоталамус, таламус, базальные ядра, затылочные доли, теменные доли, височные доли, лобные доли. Гипофиз не изолируется вместе со всем мозгом и может быть отделен в последнюю очередь.
Органы измельчают в стерильной чашке Петри стерильными, острыми ножницами до визуально гомогенного состояния, затем в гомогенат, добавляют 10 - 15 мл охлажденного (+4oC) стерильного физраствора и суспендируют стерильной пипеткой. После этого одноразовым шприцом через иглу 0,8х38 производят дополнительную гомогенизацию. Полученный гомогенат переносят в стерильные центрифужные пробирки, содержащие 5-кратный объем охлажденного (+4oC) стерильного физраствора. Пробирку оставляют на 3-5 мин для осаждения недезагрегированных кусочков ткани, затем надосадочную жидкость, содержащую отдельные клетки, отбирают и переносят в другую стерильную центрифужную пробирку. Осадок, содержащий кусочки ткани, подвергают дополнительной механической или энзиматической дезагрегации. Суспензию клеток центрифугируют в течение 10 мин при 1000 оборотах в мин, после чего надосадочную жидкость сливают.
Суспензии, прошедшие контроль стерильности, могут использоваться сразу в виде трансплантата из отдельных тканей, композиций тканей, передаваться на хранение в банк либо служить исходным биоматериалом для получения клеточных трансплантатов.
Проверенный на стерильность материал суспендируют в среде для замораживания - 10% DMSO (в качестве криопротектора) и 90% эмбриональной сыворотки теленка, затем помещают в криопробирки (Costar), по 1,5 мл (2-50•106клеток/пробирку) и замораживают в парах жидкого азота со скоростью 1oC/мин до -40oC и 5oC/мин - 70oC. После этого охлажденные криопробирки с суспензией помещают в жидкий азот в сосуды Дьюара (35 литров, Sigma), либо в хранилища для биопродуктов (ХБ-0.5, Свердловский завод кислородного машиностроения).
Хранящиеся в банке суспензии находятся в криопробирке емкостью 2 мл или 4 мл, содержащую стерильную гомогенную жидкость от светло-желтого до розово-оранжевого цвета с концентрацией клеток от 1 млн. в мл до 50 млн. в мл.
Срок хранения суспензии в жидком азоте - 3 года.
Ограничивающее условие определено нами опытным путем на основе анализа жизнеспособности 167 образцов суспензий (p<0,05).
После размораживания осуществляют контроль жизнеспособности клеток суспензии.
Замороженную суспензию (по 1 ампуле из каждой партии) быстро размораживают при 60oC, отмывают физраствором для удаления среды для замораживания (центрифугирование в течение 1-2 минут при 1000 об/мин) и окрашивают витальным красителем трипановым синим по стандартной методике. Жизнеспособность клеток должна составлять не ниже 80%. Если этот показатель ниже, то такие образцы отбраковывают. При строгом соблюдении режима замораживания и последующем быстром размораживании жизнеспособность, как правило, составляет 80-95% (общая статистика 70, уровень значимости p<0,05).
Изучение эмбриогенеза, особенно органогенеза, показало, что в первый триместр беременности в зародыше закладываются и формируются "в миниатюре" все органы. На стадии после 15-ой недели развития органы зародыша представлены в 35-60% региональными стволовыми клетками (РСК), которые затем в течение 6 последующих месяцев развития интенсивно делятся, превращаясь в часть органа.
Теоретически идеальным трансплантатом является тот, который содержит 100% РСК. Однако простой расчет показывает, что для получения достаточного только для одной трансплантации РСК необходимо в сотни раз увеличить количество исходного абортного материала. Поэтому практически, для подготовки трансплантата, используют абортный материал более поздних чем 15 недель сроков гестации, когда количество РСК резко возрастает, применяют культивирование РСК, добавляют частично дифференцированные клетки, а также стимулируют "спящие" камбиальные РСК реципиента ростовыми факторами, цитокинами или другими биологически активными веществами, содержащимися в фетальных тканях.
Таким образом, основными компонентами трансплантата являются РСК, частично дифференцированные, специализированные клетки и биологически активные вещества, стимулирующие регенерацию собственных РСК реципиента.
В настоящее время уже установлено место первичной локализации РСК для разных органов и тканей. Это было сделано с применением тонких дорогостоящих методов, что затрудняет использование их в технологическом процессе при широкой практике подготовки и применения трансплантата.
Предлагается к патентованию технологически более подходящий способ определения наибольшей плотности: региональных стволовых клеток. Способ заключается в том, что в образцах суспензий, полученных из областей первичной локализации РСК, определяют уровень аноптотической активности по CD 95 и наличие на поверхности этих клеток антигенов гистосовместимости II-класса HLA-DR. Опыт применения этих двух методов одновременно для определения образца суспензий с наибольшей плотностью РСК позволяет получить от 75 до 85% жизнеспособных РСК, что достаточно для дальнейшего их культивирования Общая статистика - 87 измерений. Вариабельность по тканям от 6 до 8 измерении. Уровень значимости - p<0,05 - 0,001.
Культивирование РСК проводят в специальных условиях, не позволяющих, им дифференцироваться.
При выращивании клеток в недифференцирующих условиях, культура РСК может поддерживаться не более одного года.
Ограничивающее условие получено нами опытным путем на основании анализа жизнеспособности 8 образцов РСК (p<0,05) Получение частично дифференцированных и специализированных клеток Если РСК поместить в условия, позволяющие ей дифференцироваться, то через примерно 3 недели можно получить специализированные клетки, практически не отличающиеся от клеток из области окончательной их локализации. При этом все они будут нести антигены гистосовместимости II-класса (HLA-DR). Такого рода клетки добавляют в трансплантат в качестве источника композиции биологически активных веществ для стимуляции собственных репаративных механизмов реципиента, поскольку они распознаются и уничтожаются иммунной системой больного, в результате чего высвобождаются эти биологически активные вещества.
Опытным путем нами получено, что терапевтическая эффективность такого рода клеток резко падает после 3-5 пассажей.
Ограничивающее условие получено при N =12 (p<0,05) При трансплантации с целью замещения дефектного клона клеток должны использовать частично дифференцированные клетки. Опытным путем нами получено, что терапевтическая эффективность оптимальна при экспрессии антигенов гистосовместимости II-класса не более 8-15%.
Ограничивающее условие получено при N = 47 (p<0,05) Получение композиции пептидов, стимулирующих РСК реципиента Все процедуры производятся при 0oC. В максимально "мягких" условиях из ткани готовится гомогенат на дистиллированной воде и (или) изотоническом растворе хлорного калия (11,5 г на 1 литр дистиллированной воды - 15% раствор). В последнем случае гомогенат центрифугируют при 600g 10 мин и осадок из неразрушенных клеток и обрывков разрушенных клеток используют для тестирования. Далее следует этап центрифугирования при 12000g в течение 15 мин - оседают митохондрии - осадок используется так же, как и первый, т.е. как осадок 600g. Следующий этап центрифугирование постмигохондриальной надосадочной жидкости при 105000g в течение часа - получение осадка мембран эндоплазматического ретикулума. Фракции осадка, кроме осадка 600g, ресуспендируют в дистиллированной воде и (или) дополнительно могут быть "озвучены" на 3 ДН с целью солюбилизации периферического белка мембран и разрушения компонентов субклеточных структур, содержащих растворимые белки и биоактивные пептиды.
Испытания фракции проводятся или в виде самой фракции как таковой или после экстракции пептидов по известным (общепринятым) методикам. Экстракты для характеристики пептидного состава подвергаются ВЭЖ хроматографии.
В случае приготовления гомогената ткани на дистиллированной воде, последний готовится в максимально жестких условиях: допустимо повторное замораживание-оттаивание, дополнительное озвучивание на ультразвуковом дезинтеграторе (3 Д) при максимальной мощности и т.д. Гомогенат центрифугируется при 105000g в течение 1 часа. Во всех случаях допустим этап лиофильной сушки осадка или супернатанта с целью концентрации материала.
Инъекционная форма трансплантата готовится из суспензий, полученных сразу после препарирования абортного плода, из замороженных тканевых и клеточных суспензий различных органов, из отдельных идентифицированных культур РСК, региональных бластных клеток, дифференцированных клеток, а также из композиций биологически активных веществ из фетальных тканей. Она представляет собой стерильную пробирку с мутноватой жидкостью от светло-желтого до розово-оранжевого цвета.
Для получения отчетливого эффекта в тансплантате должно содержаться от 25•104до 10•107жизнеспособных клеток.
В настоящее время существует несколько методических подходов к паспортизации. Среди них можно выделить: иммуноцитохимические методы, методы оценки ферментативной активности, метод проточной цитофлуориметрии.
Иммуноцитохимические методы используются только для идентификации клеток, прикрепленных к субстрату (пластик, стекло) и готовых к дифференцировке. Идентификацию проводят по реакции на специфические мембранные маркеры или по наличию специфического биологического продукта этих клеток.
Методы изучения ферментативной активности клеток, входящих в состав трансплантата, дают возможность оценить норму реакции наиболее важных для жизнеспособности и ферментов (в том числе и ядерных ферментов) в ответ на различные индукторы. Примером использования ферментативных методов является оценка индуцированой активности Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы.
На основании накопленного нами опыта впервые для паспортизации предлагается использовать метод проточной цитофлуориметрии, позволяющий одновременно в одном и том же образце трансплантата оценить основные показатели сохранности терапевтической полипатентности водящих в состав трансплантата компонентов. В результате применения этого метода впервые установлено, что трансплантат с оптимальной терапевтической полипатентностью должен отвечать следующим требованиям: количество клеток в трансплантате от 25•104до 10•107, жизнеспособность всех клеток, составляющих трансплантат - не менее 80-90%, экспрессия антигенов гистосовместимости II класса не более 8- 15%, спонтанная активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы не менее - 0,1 условной ед., индуцированная активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы - от 0,3 до 9 условных ед., представленность маркера CD 95 не более 5%.
Общая статистика - 375. Вариабельность по показателям от 30 до 85. Уровень значимости p<0,05 - p<0,001.
Предлагаемый способ приготовления трансплантата позволяет формировать банк биоматериалов, который включает: набор тканевых и клеточных суспензий различных органов, отдельные идентифицированные культуры РСК, региональные бластные клетки, обладающие повышенными миграционными свойствами, дифференцированные региональные клетки, специализированные клетки (типа бета-клеток поджелудочной железы), "эталоны" паспортизированных трансплантатов, а также композиции биологически активных веществ из фетальных тканей. Манипулирование перечисленными биоматериалами при составлении композиции трансплантата открывает перед терапевтами практически неограниченные возможности вплоть до индивидуального подбора каждому больному при составлении трансплантата подбирают те ткани и клетки, которые в наибольшей степени утратили свою функцию.
Немаловажное значение при составлении трансплантата имеет учет возраста больного. При всех прочих равных условиях трансплантат для лечения более молодых пациентов должен содержать больше дифференцированных клеток и/или композицию биологически активных веществ для стимуляции собственных РСК реципиента, в то время как в трансплантате для пожилых и старых пациентов в подавляющем большинстве должны преобладать РСК.
При составлении клеточного трансплантата следует ориентироваться, как на основное заболевание, так и на породившие его причины. Так, например, при ишемической болезни сердца эффективность лечения выше, если в трансплантате присутствуют не только миоциты, но и бластные клетки печени, легкого, селезенки и сосудистого эндотелия. Трансплантат, составленный для лечения рассеянного склероза, должен состоять преимущественно из клеток промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени способны к миграции, а трансплантат для лечения анемий должен состоять из региональных гемопоэтических клеток.
Клеточные трансплантаты могут быть составлены для лечения болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ, болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм, новообразования, болезни глаз и его придаточного аппарата, болезни уха и сосцевидного отростка, системы кровообращения, органов дыхания, органов пищеварения, кожи и подкожной клетчатки, костно-мышечной системы и соединительной ткани, отдельные состояния, возникающие в перинтальном периоде, травмы, отравления.
Документы, цитированные в отчёте о поиске3
Номер документа Дата публикации Авторы Название
SU1711896A1 1992.02.15 ОНИЩЕНКО НИНА АНДРЕЕВНА Способ лечения длительно незаживающих ран
RU2132688C1 1999.07.10 Шорох Дмитрий Бориславович (UA) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
RU2041715C1 1995.08.20 Николаенко А.Н. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ СРЕДСТВО, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННОЕ СРЕДСТВО, И СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРЕПАРАТА
Документы, со ссылками на патент20
Номер документа Дата публикации Авторы Название
RU2538701C1 2015.01.10 Мальчевский Владимир Алексеевич (RU) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ КУРИНОГО ЭМБРИОНА ИЗ ЯЙЦА ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕГО ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ ИЗ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
RU2299073C1 2007.05.20 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (ВАРИАНТЫ)
RU2234929C2 2004.08.27 Миронов Н.В. (RU) РЕТРОБУЛЬБАРНЫЙ МЕТОД ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ВВЕДЕНИЕМ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
RU2242981C1 2004.12.27 Гольдштейн Д.В. (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СУСТАВНОГО ХРЯЩА
RU2225211C1 2004.03.10 Камакин В.В. СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНОВ ПАЦИЕНТА
RU2284190C1 2006.09.27 Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА, ИЛИ ИНФАРКТА МИОКАРДА И ЕГО ПОСЛЕДСТВИЙ, ИЛИ ИШЕМИИ МОЗГА, ВЫЗВАННОЙ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ ИЛИ ОСТРЫМ НАРУШЕНИЕМ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ, И ЕЕ ПОСЛЕДСТВИЙ, ИЛИ ИШЕМИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ, ВЫЗВАННОЙ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ
RU2203072C1 2003.04.27 Курбатова Г.Р. СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СУСПЕНЗИИ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ
RU2298410C1 2007.05.10 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТИЧЕСКИХ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
RU2242980C1 2004.12.27 Гольдштейн Д.В. (RU) КУЛЬТУРА ГЕНЕТИЧЕСКИ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ХОНДРОПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
RU2261718C2 2005.10.10 Кочеткова Н.Г. (RU) СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА
RU2330675C2 2008.08.10 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) ТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
RU2214256C2 2003.10.20 Седов В.М. СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК, СОСТАВ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАН, ОЖОГОВ И ЯЗВ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
RU2295351C1 2007.03.20 Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА ИЛИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ
RU2300384C2 2007.06.10 Бурда Юрий Евгеньевич (RU) ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
RU2238745C2 2004.10.27 Миронов Н.В. (RU) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ И ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ГИПОКСИЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ОРГАНИЧЕСКИМИ ПОРАЖЕНИЯМИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ
RU2233665C2 2004.08.10 Рабинович С.С. (RU) СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕТСКОГО ЦЕРЕБРАЛЬНОГО ПАРАЛИЧА
RU2268061C1 2006.01.20 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА
RU2265445C1 2005.12.10 Гольдштейн Д.В. (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА
RU2228187C2 2004.05.10 Плеханов Л.А. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ
RU2286159C1 2006.10.27 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ
Похожие документы20
Номер документа Дата публикации Авторы Название
RU2744732C1 2021.03.15 Ковалев Алексей Вячеславович (RU) Биокомпозитный сфероид для восстановления костей и способ его получения
RU2052193C1 1996.01.10 Полещук Николай Николаевич[BY] СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКЛАССИЧЕСКОГО ВИРУСА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
RU2499609C1 2013.11.27 САИТО Итиро (JP) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЗУБНОЙ ПУЛЬПЫ И СПОСОБ ПЕРЕНОСА ЭКСТРАГИРОВАННОГО ЗУБА НА ХРАНЕНИЕ
RU2711330C2 2020.01.16 ЛАЦА Жомбор (HU) СЫВОРОТОЧНАЯ ФРАКЦИЯ ОБОГАЩЕННОГО ТРОМБОЦИТАМИ ФИБРИНА
RU2455354C1 2012.07.10 Колесникова Антонина Ивановна (RU) КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК
RU2692452C1 2019.06.24 Хашукоев Адальби Заурбиевич (RU) Способ замещения костных дефектов челюстей
RU2542430C2 2015.02.20 ДЮФРАН Дени (BE) МНОГОМЕРНЫЙ БИОМАТЕРИАЛ И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ
RU2236855C2 2004.09.27 АСИНА Ширин (US) КОМПОЗИЦИИ ПОДВЕРГНУТЫХ РЕСТРИКЦИИ КЛЕТОК, СПОСОБНЫХ К БЫСТРОМУ РОСТУ, КОТОРЫЕ ПРОДУЦИРУЮТ ВЕЩЕСТВА, ПОДАВЛЯЮЩИЕ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
RU2320720C2 2008.03.27 Парфенова Елена Викторовна (RU) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
RU2268735C1 2006.01.27 АСИНА Ширин (US) КОМПОЗИЦИИ ПОДВЕРГНУТЫХ РЕСТРИКЦИИ КЛЕТОК, СПОСОБНЫХ К БЫСТРОМУ РОСТУ, КОТОРЫЕ ПРОДУЦИРУЮТ ВЕЩЕСТВА, ПОДАВЛЯЮЩИЕ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
RU2570034C1 2015.12.10 Хафизов Раис Габбасович (RU) СПОСОБ НАРАЩИВАНИЯ ОБЪЕМА КОСТНОЙ ТКАНИ В ЗОНАХ ДЕФЕКТА АЛЬВЕОЛЯРНОГО ОТРОСТКА ЧЕЛЮСТИ
RU2173986C2 2001.09.27 ДЖЕЙН Кэнти (US) ИМПЛАНТИРУЕМЫЕ АГАРОЗНО-КОЛЛАГЕНОВЫЕ ШАРИКИ, СОДЕРЖАЩИЕ КЛЕТКИ, КОТОРЫЕ ПРОДУЦИРУЮТ СПОСОБНЫЙ К ДИФФУЗИИ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОДУКТ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
RU2620167C1 2017.05.23 Ткачук Всеволод Арсеньевич (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ НА ОСНОВЕ ПРОДУКТОВ СЕКРЕЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
RU2145882C1 2000.02.27 Брэдфорд С.Уэбб (US) СИНТЕТИЧЕСКИЙ ВЯЗКОЭЛАСТИЧНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ
RU2644650C2 2018.02.13 Соколов Анатолий Андреевич (RU) МАТЕРИАЛ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
RU2727540C1 2020.07.22 Курбангалеева Сирина Василевна (RU) Применение мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, для восстановления и повышения митохондриальной функции
RU2177503C2 2001.12.27 ДЖАЙН КАНТИ (US) МАКРОГРАНУЛА С СЕКРЕТОРНЫМИ КЛЕТКАМИ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СЕКРЕТОРНЫХ КЛЕТОК
RU2652902C1 2018.05.03 Ткачук Всеволод Арсеньевич (RU) СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА
RU2330675C2 2008.08.10 Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU) ТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
RU2530169C2 2014.10.10 КОФФИ,Питер (GB) МЕМБРАНА В КАЧЕСТВЕ ПОДЛОЖКИ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ (ВАРИАНТЫ), ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СПОСОБ ЗАСЕВАНИЯ ТАКИХ КЛЕТОК
Оценили 9 человек
15 кармы