giphy.com
Немецкие биологи усовершенствовали систему редактирования генома «спящая красавица» — это способ доставки генов в клетку на основе мобильных элементов. Новый вариант метода позволяет избежать бесконтрольного встраивания «груза» в геном. Он работает как на взрослых, так и на стволовых клетках, а технология генной терапии CAR-T с его применением становится быстрее и безопаснее. Работа опубликована в журнале Nature Biotechnology.
Самый простой способ редактировать геном — использовать вирусы, которые своим существованием обязаны умению «вписывать» свои гены в чужую ДНК. На основе обезвреженных вирусов, или вирусных векторов, работают все одобренные для применения методы генной терапии. Однако у этого способа есть свои минусы: например, вирусы иммуногенны, и даже обезвреженная их версия вызывает иммунную агрессию, поэтому возможно отторжение отредактированных клеток.
В последнее время все большую популярность набирают методы «точечного редактирования» — это, например, система CRISPR/Cas9 или «цинковые пальцы». Эти системы позволяют встраивать «груз» не в случайное, а в строго определенное место на хромосоме. Но и у них есть недостатки: они то и дело промахиваются (это называют нецелевым редактированием), а еще не позволяют встроить в геном достаточно большой груз.
Есть и третье направление редактирования генома — с помощью мобильных генетических элементов, или транспозонов. Это участки ДНК, которые способны вырезать себя из одного места генома и встроить в другое — для этого они кодируют фермент транспозазу. Многие такие последовательности в нашем геноме потеряли активность со временем. Но в 1997 году ученые восстановили один из предковых вариантов транспозазы, который «замолчал» в геноме рыб миллионы лет тому назад — и назвали его «спящей красавицей», в честь долгого «сна» и внезапного «пробуждения».
«Спящую красавицу» уже пробовали использовать на клетках человека, и некоторые технологии с ее применением дошли до 1-2 фазы клинических испытаний. Эта система редактирования устроена следующим образом: в клетку вводят плазмиду (кольцевую ДНК) с геном транспозазы и другую плазмиду — с «грузом». Клетка производит транспозазу, а та распознает «груз», отрезает его от плазмиды и вносит разрывы в ДНК, на место которых встраивается груз.
Эта система работает эффективно, но с ней есть одна трудность: она не позволяет контролировать работу транспозазы — сколько раз она сумеет встроить «груз» в геном и не попадет ли вместе с ним что-то лишнее. Поэтому клетки, которые редактируют таким способом, после этого долго — до месяца — культивируют, чтобы убедиться в том, что в них не возникло лишних мутаций. Но не каждый пациент — особенно, если речь идет о CAR-T терапии, когда в иммунные клетки «вживляют» рецептор для опухолевых белков — может прождать так долго.
Ирма Керкес (Irma Querques) и ее коллеги из Европейской молекулярной биологической лаборатории (EMBL) в Гейдельберге разработали новый вариант системы на основе «спящей» красавицы. Они предложили вводить в клетку не плазмиду с ферментом транспозазой, а белок в чистом виде. Предыдущие попытки этого добиться закончились неудачей, потому что транспозаза слипается в комки и плохо проходит через мембрану.
Исследователи заменили две аминокислоты в составе транспозазы, что сделало белок более растворимым в воде. Полученную «гипер-растворимую» транспозазу они поместили в клетки с помощью электропорации и сравнили результат с обычной плазмидой: чистый белок постепенно исчез из клеток в течение суток, а плазмида оставалась на месте по меньшей мере 5 дней. Это означает, что действие «усовершенствованной» транспозазы будет коротким, а следовательно, она сможет внести меньше лишних мутаций в геном.
Ученые опробовали свой метод на опухолевых клетках HeLa, затем на эмбриональных стволовых и на кроветворных клетках. И только после этого решили применить его в реальной технологии — CAR-T. Исследователи взяли человеческие Т-клетки и внесли в них ген химерного рецептора, который распознает В-клеточную лимфомы. Эффективность встраивания получилась около 20-30 процентов — примерно такая же, как и в реальной технологии CAR-T, которую применяют в клинике и которая основана на вирусной доставке гена.
В культуре отредактированные клетки уничтожили более 60 процентов опухолевых клеток на своем пути, а также вылечили больных лимфомой мышей в течение недели. При этом в каждой Т-клетке ученые обнаружили около 5 встраиваний гена в ДНК — это в два раза меньше, чем если бы в клетку попала кольцевая ДНК с геном транспозазы. Кроме того, ген примерно в четверти случаев встроился в «безопасные» места генома — это примерно так же часто, как если бы он встраивался случайным образом, и в 8,5 раз чаще, чем векторы на основе ВИЧ.
Авторы работы отмечают, что их новая система может продвинуть редактирование с помощью транспозазы в клинических исследованиях. Она работает безопаснее, чем предыдущие аналогичные методы, но позволяет переносить больший груз, чем точечные редакторы вроде CRISPR/Cas9. Идеальным вариантом, по мнению исследователей, стала бы синтетическая конструкция, которая сочетает в себе точность CRISPR/Cas9 и низкое число осечек транспозазы.
Споры о безопасности генетических редакторов продолжаются. Недавно, например, ученые показали, что потомство отредактированных животных не несет в себе лишних мутаций. А также придумали новый метод редактирования, который оказался еще точнее, чем классическая система CRISPR/Cas9.
Полина Лосева
Оценили 7 человек
6 кармы